本发明公开了一种聚乙二醇修饰的干扰素偶联物，其制备方法，以及含有治疗有效量的该干扰素偶联物的药物组合物，及其在制备抗病毒、抗肿瘤、免疫调节药物中的用途。
1.一种结构如式(I)所示的干扰素偶联物，P-NH-CH₂-X-S-Y-Q(I)其中，P是干扰素；X是-(CH₂)_k-，k为1～4之间的整数；Q是甲氧基聚乙二醇；Y选自Y2：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中m＝2，n＝2；所述干扰素是重组人干扰素α，每个甲氧基聚乙二醇基团的平均分子量为5,000-40,000道尔顿。
2.根据权利要求1所述的干扰素偶联物，其特征在于，所述偶联物选自式(Ⅱ)所示化合物：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中，P是干扰素，X是-(CH₂)_k，k为1～4之间的整数，m＝2，n＝2，m₁选自100～2000之间的整数。
3.根据权利要求1所述的干扰素偶联物，其特征在于，所述干扰素是重组人干扰素α2b。
4.根据权利要求1所述的干扰素偶联物，其特征在于，k＝2。
5.根据权利要求1所述的干扰素偶联物，其特征在于，m₁选自450-600之间的整数。
6.根据权利要求1所述的干扰素偶联物，其特征在于，每个甲氧基聚乙二醇基团的平均分子量为20,000道尔顿。
7.一种制备权利要求1-6任意一项所述干扰素偶联物的方法，其包括以下步骤：1)干扰素和含有已保护巯基的醛类物质反应，形成通过-NH-CH₂-键连接的活化干扰素蛋白；2)所述活化的干扰素蛋白脱保护，与活性甲氧基聚乙二醇衍生物偶联。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述醛类物质是式(Ⅹxa0Ⅳ)的小分子醛化合物，ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="561"/>其中k的数目选自2～4之间的整数。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，k为2。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述活性甲氧基聚乙二醇衍生物是通式为(Ⅹxa0Ⅵ)的活化甲氧基聚乙二醇，ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>AG选自：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="642"/>其中m＝2，n＝2。
11.根据权利要求10所述的方法，包括以下步骤：(1)制备结构通式为(Ⅹxa0Ⅳ)的小分子醛化合物，ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="561"/>其中k的数目选自2～4之间的整数；(2)将结构通式为(Ⅹxa0Ⅳ)的小分子醛化合物与干扰素在缓冲液里反应，并加入还原剂得到结构通式为(Ⅹxa0Ⅴ)的活化干扰素，ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中P是指干扰素；(3)在含有活化干扰素的缓冲液里加入脱保护剂脱去结构通式为(Ⅹxa0Ⅴ)的活化干扰素的乙酰基保护基，随后加入结构通式为(Ⅹxa0Ⅵ)的活化甲氧基聚乙二醇进行聚乙二醇化反应，得到聚乙二醇干扰素偶联物，ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>AG选自：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="641"/>其中m＝2，n＝2；(4)纯化聚乙二醇干扰素偶联物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中k为2。
13.根据权利要求11所述的方法，其中P是重组人干扰素α2b。
14.一种药物组合物，其包含：1)如权利要求1-6任意一项所述的治疗有效量的聚乙二醇化干扰素偶联物；2)药学可接受的药物载体。
15.权利要求1-6任意一项所述的聚乙二醇化干扰素偶联物，权利要求14所述的药物组合物，在制备抗病毒、抗肿瘤、免疫调节药物中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述用途为在制备治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎和戊型肝炎、带状疱疹、扁平和尖锐湿疣、乳头瘤病毒感染、流行性出血热、小儿呼吸道合胞病毒肺炎、毛细胞性白血病、慢性粒细胞白血病、黑色素瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、卵巢癌、直肠癌、肝癌、肺癌的药物中的用途。技术领域
本发明涉及一种聚乙二醇干扰素偶联物，该偶联物通过一种新颖的生物蛋白分子的聚乙二醇修饰技术合成，具有抗病毒感染、抗肿瘤、免疫调节等生物学活性，本发明的应用领域涉及生物化学、药物化学以及人类疾病的治疗。
背景技术
干扰素(nterferon)是一组具有多种功能的活性蛋白质，是一类重要的家族性细胞因子，具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖、和免疫调节作用。哺乳动物的干扰素可以分为α、β、γ、ω等几种类型，其中α干扰素又可分十余种亚型，经大量临床研究证明α型干扰素是一种重要的抗病毒和抗肿瘤治疗药物。目前我国在临床使用最广泛的主要是重组人干扰素α1b、α2b和α2a。另外，美国Amgen公司根据13种α型干扰素的基因序列同源性，设计出的一种全新的蛋白质工程药物干复津ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="372"/>IFN-Con-1)于1997年经FDA批准上市用于治疗丙型肝炎，其病毒活性是α2b干扰素的5～10倍。但是，一般来说，许多有生物技术(如基因重组)表达所得的产品，包括干扰素，都是通过非肠道给药途径而进入生物体内发挥其药效作用。此类由非肠道给药的生物大分子药物产品通常存在下面的一些问题：(1)生物大分子药物往往具有致敏性反应，生物体内产生的抗体会对生物体造成严重的伤害并影响治疗的进行；(2)生物大分子药物本身因受到抗体的影响或因蛋白分解酶而引起的代谢作用，致使其生物半衰期大为缩短；(3)生物大分子的稳定性差，保存困难。所以，无论是干扰素α1b、α2b和α2a还是干复津，作为蛋白质药物，由于稳定性差，血浆清除率高，体内半衰期短，易产生抗原抗体反应等，在临床治疗中受到很大的限制，这些缺点造成的结果是：需频繁注射干扰素才能达到有效的血浆治疗浓度；而且，每次注射后均会导致血液浓度的较大波动，形成药物浓度的峰值与谷值。这样就可能增加了治疗费用以及给药不便和不良反应的风险。因此，人们试图采用各种药物传递技术(Drugxa0Deliveryxa0Technology)，来提高蛋白质药物的疗效。而目前在药物传递技术中研究最为广泛的是聚乙二醇修饰技术（PEGNOLOGY)。1980年，Davis等人在美国专利4,179,337中公开了利用单一分子不同聚合度的聚乙二醇对蛋白药物进行的化学修饰，在保持药物的生物活性同时，药物的抗原性降低，Verones等人在Appliedxa0Biochemxa0andxa0Biotech11，142(1985)上公开发表了用氯甲酸苯酯活化的聚乙二醇修饰核糖核酸酶和超氧化物歧化酶，增加了蛋白的生物半衰期。上述现有技术文献报导已表明聚乙二醇修饰技术的确可以解决非肠道给药生物大分子药物存在的一些问题。目前，市场上已经有两种聚乙二醇化干扰素产品，分别是Scheringxa0Plough公司的PEG-IFNα2b(PEG-INTRON)与Hoffman-laxa0Roche公司的PEG-IFNα2a(PEGASYS)，提高了干扰素在体内的半衰期，达到每周注射一次，使得干扰素的生物利用度得到了一定程度的提升。这两个产品已占有国外干扰素市场60％，获得了巨大的经济效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物学活性更好、生物利用度更高的的聚乙二醇修饰的干扰素偶联物，其结构如式(I)所示：P-NH-CH₂-X-S-Y-Qxa0xa0xa0xa0(I)其中，P是干扰素，包括所有类型的干扰素，以及这些类型所有的亚类，以及不同类型和／或亚类干扰素组成的复合干扰素；P可以是任何来源的，包括天然来源、组织培养或由基因重组技术得到的干扰素；P优选天然的或人工重组的干扰素蛋白，更优选重组人干扰素，更优选重组人干扰素α、β、γ或ω，最优选α2b；P既可通过本领域公开的技术制得，也可在市场上购得；X是-(CH₂)_k-或-CH₂(OCH₂CH₂)_k-，k选自2～10的整数，优选1～4，进一步优选为2；Q为甲氧基聚乙二醇，其平均分子量优选5,000～40,000道尔顿，更优选20,000道尔顿；Y选自Y1～Y12，其中，m、n各自独立地选自2～10的整数，优选为2，ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="505"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="417"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>或ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="700"/>具体而言，本发明提供一种结构通式为(Ⅱ)的偶联物：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中P是指干扰素，X是-(CH₂)_k-或-CH₂(OCH₂CH₂)_k-，k的数目选自1～10，m、n的数目选自2～10，m₁选自100～2000之间的整数。其中X优选为-(CH₂)_k-，k的数目可进一步优选自1～4，最优选的是2。对上述优选实施方案进一步优选，本发明还提供了最优选的一个实施方案，对应的结构式为：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>m₁选自450～600的整数，其中P是指干扰素，可进一步优选重组人干扰素，再优选重组人干扰素α，最优选重组人干扰素α2b。本发明还提供一种结构通式为(Ⅲ)的偶联物：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中P是指重组人干扰素，X是-(CH₂)_k-或-CH₂(OCH₂CH₂)_k-，k的数目选自1～10，m的数目选自2～10，m₁选自100～2000之间的整数。对结构式(Ⅲ)进一步优选，所对应的最优选实施方案需要同时满足以下条件：P是指重组人干扰素α；X是-(CH₂)_k-，其中k是2；m的数目选自2；m₁选自450～600的整数。本发明还提供一种结构通式为(Ⅳ)的偶联物：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中P是指重组人干扰素，X是-(CH₂)_k-或-CH₂(OCH₂CH₂)_k-，k的数目选自1～10，m的数目选自2～10，m₁选自100～2000之间的整数。对结构式(Ⅳ)进一步优选，所对应的最优选实施方案需要同时满足以下条件：P是指重组人干扰素α；X是-(CH₂)_k-，其中k是2；m的数目选自2；m₁选自450～600的整数。本发明还提供一种结构通式为(V)的偶联物：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中P是指重组人干扰素，X是-(CH₂)_k-或-CH₂(OCH₂CH₂)_k-，k的数目选自1～10，m₁选自100～2000之间的整数。对结构通式为(V)的偶联物进一步优选，所对应的最优选实施方案需要同时满足以下条件：P是指重组人干扰素α；X是-(CH₂)_k-，其中k是2；m₁选自450～600的整数。本发明还提供一种结构通式为(Ⅵ)的偶联物：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中P是指重组人干扰素，X是-(CH₂)_k-或-CH₂(OCH₂CH₂)_k-，k的数目选自1～10，m的数目选自2～10，m₁选自100～2000之间的整数。对结构式(Ⅵ)进一步优选，所对应的最优选实施方案需要同时满足以下条件：P是指重组人干扰素α；X是-(CH₂)_k-，其中k是2；m的数目选自2，m₁选自450～600的整数。本发明还提供一种结构通式为(Ⅶ)的偶联物：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中P是指重组人干扰素，X是-(CH₂)_k-或-CH₂(OCH₂CH₂)_k-，k的数目选自1～10，m、n的数目各自独立地选自2～10的整数，m₁选自100～2000之间的整数。对结构通式为(Ⅶ)的偶联物进一步优选，所对应的最优选实施方案需要同时满足以下条件：P是指重组人干扰素α；X是-(CH₂)_k-，其中k是2；m、n的数目选自2；m₁选自450～600的整数。本发明还提供一种结构通式为(Ⅷ)的偶联物：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中P是指重组人干扰素，X是-(CH₂)_k-或-CH₂(OCH₂CH₂)_k-，k的数目选自1～10，m的数目选自2～10，m₁选自100～2000之间的整数。对结构式(Ⅷ)进一步优选，所对应的最优选实施方案需要同时满足以下条件：P是指重组人干扰素α；X是-(CH₂)_k-，其中k是2；m的数目选自2；m₁选自450～600的整数。本发明还提供一种结构通式为(Ⅸ)的偶联物：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中P是指重组人干扰素，X是-(CH₂)_k-或-CH₂(OCH₂CH₂)_k-，k的数目选自1～10，m，n的数目选自2～10，m₁选自100～2000之间的整数。对结构式(Ⅸ)进一步优选，所对应的最优选实施方案需要同时满足以下条件：P是指重组人干扰素α；X是-(CH₂)_k-，其中k是2；m，n的数目选自2；m₁选自450～600的整数。本发明还提供一种结构通式为(X)的偶联物：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中P是指重组人干扰素，X是-(CH₂)_k-或-CH₂(OCH₂CH₂)_k-，k的数目选自1～10，m的数目选自2～10，m₁选自100～2000之间的整数。对结构通式为(X)的偶联物进一步优选，所对应的最优选实施方案需要同时满足以下条件：P是指重组人干扰素α；X是-(CH₂)_k-，其中k是2；m的数目选自2，m₁选自450～600的整数。本发明还提供一种结构通式为(XI)的偶联物：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中P是指重组人干扰素，X是-(CH₂)_k-或-CH₂(OCH₂CH₂)_k-，k的数目选自1～10，m的数目选自2～10，m₁选自100～2000之间的整数。对结构式(XI)进一步优选，所对应的最优选实施方案需要同时满足以下条件：P是指重组人干扰素α；X是-(CH₂)_k-，其中k是2；m的数目选自2，m₁选自450～600的整数。本发明还提供一种结构通式为(Ⅻ)的偶联物：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中P是指重组人干扰素，X是-(CH₂)_k-或-CH₂(OCH₂CH₂)_k-，k的数目选自1～10，m、n的数目各自独立地选自2～10的整数，m₁选自100～2000之间的整数。对结构通式为(Ⅻ)的偶联物进一步优选，所对应的最优选实施方案需要同时满足以下条件：P是指重组人干扰素α；X是-(CH₂)_k-，其中k是2；m、n的数目选自2；m₁选自450～600的整数。发明还提供一种结构通式为(XⅢ)的偶联物：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中P是指重组人干扰素，X是-(CH₂)_k-或-CH₂(OCH₂CH₂)_k-，k的数目选自1～10，m、n的数目各自独立地选自2～10的整数，m₁选自100～2000之间的整数。对结构通式为(XⅢ)的偶联物进一步优选，所对应的最优选实施方案需要同时满足以下条件：P是指重组人干扰素α；X是-(CH₂)_k-，其中k是2；m、n的数目选自2；m₁选自450～600的整数。本发明的又一目的在于提供一种制备所述干扰素偶联物的方法，该方法主要包括两个阶段：首先是干扰素和含有已保护巯基的醛类物质反应，形成通过-NH-CH₂-键连接的活化干扰素蛋白；然后，所述活化的干扰素脱保护，与活性甲氧基聚乙二醇衍生物偶联，通过分离而得到。具体而言，其步骤包括：(1)制备结构通式为(XⅣ)的小分子醛化合物：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="542"/>其中k的数目选自2～10，优选2；(2)将结构通式为(XⅣ)的小分子醛化合物与干扰素在缓冲液里反应，并加入还原剂得到结构通式为(Xxa0V)的活化干扰素；ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中P是指干扰素，优选重组人干扰素α2b，缓冲液的pH选自4.0～7.0，优选4.5，还原剂可以是硼氰化钠、氰基硼氰化钠，优选氰基硼氰化钠；(3)利用本领域公知的技术在含有活化干扰素的缓冲液里加入脱保护剂脱去结构通式为(Xxa0V)的活化干扰素的乙酰基保护基，随后加入结构通式为(XⅥ)的活化甲氧基聚乙二醇进行聚乙二醇化反应，ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="698"/>其中加入的脱保护剂优选羟胺；缓冲体系的pH选自5.0～7.0，优选pH6.2；AG选自：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="649"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="616"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>其中m、n的数目选自2～10，优选2；(4)聚乙二醇干扰素偶联物的纯化方法采用本领域技术人员公知的技术，如离子交换层析、凝胶层析。本发明制备所述干扰素偶联物的方法中，结构通式为(XⅣ)的小分子醛化合物可按文献公开的已知方法制备，如US4338435。本发明的又一目的在于提供一种含有该被修饰的干扰素偶联物的药物组合物，其包含：(1)本发明所提供的治疗量的聚乙二醇化干扰素偶联物；(2)药学可接受的药物载体。本发明提供的干扰素偶联物可以通过本领域公知的方法用药学可接受载体或赋形剂制成适合注射的药物组合物，欲使用的药物组合物可制成制剂，并按与合适的医疗惯例一致的方式给药。本发明的化合物可以在含有132mM氯化钠的10mM磷酸钠／钾缓冲液pH7中配制。任选地，药物组合物可以含有防腐剂。药物组合物可以含有不同量的干扰素，例如10-1000微克／毫升，例如50微克或400微克。进一步，本发明的目的在于提供所述干扰素偶联物以及含有它们的药物组合物在制备抗病毒感染、抗肿瘤、免疫调节药物中的用途。上述疾病具体包括：慢性乙型肝炎、丙型肝炎和戊型肝炎等；病毒性疾病如带状疱疹、扁平和尖锐湿疣、乳头瘤病毒感染、流行性出血热和小儿呼吸道合胞病毒肺炎等；恶性肿瘤如毛细胞性白血病、慢性粒细胞白血病、黑色素瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、卵巢癌、直肠癌、肝癌、肺癌等。干扰素或本发明提供的聚乙二醇干扰素偶联物的生物活性可由宿主细胞致病效应测试法的颜色反应而确定。宿主细胞致病效应(CytoPathicxa0Effect，orxa0CPE)测试法系由Foti提出(Methodsxa0inxa0Enzymology，119,533,198)。本法利用人类宿主细胞经干扰素处理后产生抵抗病毒感染的活性而能防止细胞病变死亡的原理设计而成的一种简易快捷的颜色吸收反应测试方法。简单而言，宿主细胞在经干扰素处理后可抵抗病毒入侵因而可防止宿主细胞死亡。干扰素的抗病毒生物活性即可经由存活细胞所吸收的染料而直接定量测量。由此而来的采用细胞病变抑制法通过WISH-VSV系统测定干扰素的体外抗病毒活性，是本技术领域公知的方法，具体参照2005版《中华人民共和国药典》三部附录Xxa0C“干扰素的生物活性测定”。通过对本发明提供的聚乙二醇干扰素偶联物的测试数据表明：本发明提供的聚乙二醇干扰素偶联物可以达到修饰干扰素α2b分子表面氨基酸的目的且保留较多的干扰素α2b的生物活性并提供良好的药代特性。在本发明所提供的化合物中，干扰素与连接体以-NH-CH₂-键形式连接，由此增强了PEG修饰反应的专一性。
附图说明
图1是食蟹猴单次皮下给药相同剂量HH-IFN-003与PEG-IFNα-2b(PegIntron，先灵葆雅)后的血清抗原浓度-时间变化比较图。图2是食蟹猴单次皮下给药10μg·kg-1HH-IFN-003及PegIntron后血清抗病毒活性-时间变化的比较图。
具体实施方式
实施例1：乙酰基巯基丙醛的制备ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>将11.2g(0.2mmol)丙烯醛与干燥的100mlxa0THF加入到反应瓶中，冷却至0℃，然后缓慢滴加1.52g(0.02mol)硫代乙酸／20mlxa0THF的混合溶液。滴加完毕保温反应2小时后。35℃减压浓缩除去过量的丙烯醛。然后快速上柱(洗脱液纯正己烷→正己烷／乙酸乙酯＝50／1)，合并收集产物点，减压浓缩至干得油状液体0.6g。实施例2：活化干扰素的制备取600mg干扰素α2b(来自上海恒瑞医药有限公司)，蛋白浓度为1.0mg／ml，共600ml，体系为0.1M乙酸缓冲液，pH4.5；取39.6mg乙酰基巯基丙醛溶于400ul乙腈后加入以上蛋白溶液；再称取756mg氰基硼氢化钠加入上述反应液，并慢速搅拌反应，冰浴控制反应温度在10℃，反应4小时；然后将反应液转入透析袋(截留分子量3500)，对0.1M磷酸钠盐缓冲液，含2mMxa0EDTA，pH6.25进行透析，以除掉过量的小分子醛，然后再加入羟胺脱去乙酰基，得活化干扰素。说明：以下实施例(3～8)为将实施例2得到的活化干扰素用活性聚乙二醇修饰，并得到聚乙二醇干扰素的过程。目标物的代号及结构示意图见下表，其中IFN是活化干扰素α2b：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实施例3：HH-IFN-001的制备通过实施例2得到的100mg活化干扰素α2b(1.0mg／ml，0.1M磷酸钠盐缓冲液，含2mMxa0EDTA，pH6.25)，加入0.25gxa0mPEG-马来酰胺(5kD，来自SUNBIO)，搅拌反应60分钟；再加入N-甲基马来酰亚胺至浓度为5mM，室温反应30分钟，以反应掉蛋白上剩余的巯基；然后将反应液透析至20mM乙酸缓冲液体系。反应液使用离子交换层析(SPxa0Sepharosexa0H.P)纯化，得到聚乙二醇化干扰素(HH-IFN-001)，约17.5mg，经MALDI-TOF-MS检测分子量为24.6KD。实施例4：HH-IFN-002的制备向实施例2得到的含有游离巯基的100mg活化干扰素α2b(1.0mg／ml，0.1M磷酸钠盐缓冲液，含2mMxa0EDTA，pH6.25)，加入0.5gmPEG-马来酰胺(10kD，来自SUNBIO)，搅拌反应60分钟；再加入N-甲基马来酰亚胺至浓度为5mM，室温反应30分钟，以反应掉蛋白上剩余的巯基；然后将反应液透析至20mM乙酸缓冲液体系。反应液使用离子交换层析(SPxa0Sepharosexa0H.P)纯化，得到聚乙二醇化干扰素(HH-IFN-002)，约15.3mg，经MALDI-TOF-MS检测分子量为29.9KD。实施例5：HH-IFN-003的制备向实施例2得到的含有游离巯基的100mg活化干扰素α2b(1.0mg／ml，0.1M磷酸钠盐缓冲液，含2mMxa0EDTA，pH6.25)，加入1.0gmPEG-马来酰胺(20kD，来自SUNBIO)，搅拌反应60分钟；再加入N-甲基马来酰亚胺至浓度为5mM，室温反应30分钟，以反应掉蛋白上剩余的巯基；然后将反应液透析至20mM乙酸缓冲液体系。反应液使用离子交换层析(SPxa0Sepharosexa0H.P)纯化，得到聚乙二醇化干扰素(HH-IFN-003)，约16.0mg，经MALDI-TOF-MS检测分子量为40.3KD。实施例6：HH-IFN-004的制备向实施例2得到的含有游离巯基的100mg活化干扰素α2b(1.0mg／ml，0.1M磷酸钠盐缓冲液，含2mMxa0EDTA，pH6.25)，加入2.0gmPEG-马来酰胺(40kD，来自SUNBIO)，拌反应60分钟，再加入N-甲基马来酰亚胺至浓度为5mM，室温反应30分钟，以反应掉蛋白上剩余的巯基；然后将反应液透析至20mM乙酸缓冲液体系。反应液使用离子交换层析(SPxa0Sepharosexa0H.P)纯化，得到聚乙二醇化干扰素(HH-IFN-004)，约14.5mg，经MALDI-TOF-MS检测分子量为60.1KD。实施例7：HH-IFN-005的制备向实施例2得到的含有游离巯基的100mg活化干扰素α2b(1.0mg／ml，0.1M磷酸钠盐缓冲液，含2mMxa0EDTA，pH6.25)，加入1.0gmPEG-邻吡啶基-二硫化物(20KD，来自SUNBIO)，搅拌反应60分钟，再加入N-甲基马来酰亚胺至浓度为5mM，室温反应30分钟，以反应掉蛋白上剩余的巯基；然后将反应液透析至20mM乙酸缓冲液体系。反应液使用离子交换层析(SPxa0Sepharosexa0H.P)纯化，得到聚乙二醇化干扰素(HH-IFN-005)，约16.0mg，经MALDI-TOF-MS检测分子量为41.0KD。实施例8：HH-IFN-006的制备向实施例2得到的含有游离巯基的100mg活化干扰素α2b(1.0mg／ml，0.1M磷酸钠盐缓冲液，含2mMxa0EDTA，pH6.25)，加入1.0g碘乙酰胺-mPEG(20KD，来自NOFxa0CORPORATION)，搅拌反应60分钟，再加入N-甲基马来酰亚胺至浓度为5mM，室温反应30分钟，以反应掉蛋白上剩余的巯基；然后将反应液透析至20xa0mM乙酸缓冲液体系。反应液使用离子交换层析(SPxa0Sepharosexa0H.P)纯化，得到聚乙二醇化干扰素(HH-IFN-006)，约16.5xa0mg，经MALDI-TOF-MS检测分子量为39.8KD。实施例9：干扰素α2b及6种聚乙二醇干扰素偶联物的体外抗病毒活性测试采用细胞病变抑制法通过WISH-VSV系统测定干扰素体外抗病毒活性。本实施例测定了7种干扰素(或衍生物)的体外抗病毒活性，具体包括：IFNα2b(上海恒瑞医药股份有限公司提供)、HH-IFN-001(本发明实施例3制备)、HH-IFN-002(本发明实施例4制备)、HH-IFN-003(本发明实施例5制备)、HH-IFN-004(本发明实施例6制备)、HH-IFN-005(本发明实施例7制备)、HH-IFN-006(本发明实施例8制备)。体外抗病毒活性测定结果见表1：表1体外抗病毒活性测定结果ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表1中数据显示，本发明所提供的聚乙二醇干扰素α2b偶联物与修饰前的干扰素α2b相比，仍保留有约7-15％的抗病毒活性。实施例10：食蟹猴单次皮下给药受试品HH-IFN-003和参比品PegIntron后的血清抗原浓度和药代动力学比较实验用Hu-IFN-αxa0ELISA药盒可以测定血清中受试品HH-IFN-003和参比品PegIntron的浓度。Hu-IFN-αxa0Immunoassay是一种放大的双夹心抗体免疫分析法，试验操作步骤遵照药盒说明书，96孔板预先用IFN-α的单抗包被，分别加入受试品HH-IFN-003和参比品PegIntron，孵育一定时间，洗板，加抗体稀释液，封板，室温孵育，再洗板，另加入携有HRP(辣根过氧化物酶)耦合物，封板，室温孵育，彻底洗板，最后加入显色底物室温避光孵育直到出现颜色；加入终止液终止反应，用酶标仪测定450nm波长处的光吸收值。光吸收值的对数值与样品中HH-IFN-003和PegIntron的浓度对数值呈正相关，对浓度对数和光吸收值对数进行双对数线性回归，绘制标准曲线，计算未知样品浓度。实验结果：与单次皮下给药先灵葆雅公司参比品组PegIntron，10μg·kg-1相比，HH-IFN-003受试品组各时间点血清抗原浓度在数值上均大于PegIntron组(见图1)，AUC(0-96h)，和AUC(0-inf)均高于PegIntron组，药代动力学参数见表2。表面单次皮下给药后，HH-IFN-003的体内暴露量要高于PegIntron。表2食蟹猴单次皮下注射受试品HH-IFN-003与PegIntron药代动力学参数比较ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实施例11：食蟹猴单次皮下给药10μg·kg^-1HH-IFN-003及PegIntron后血清抗病毒活性比较实验PEG-IFNα-2b与IFNα-2b活性测定方法采用细胞病变抑制试法(CPE法)，以WISH细胞作为病毒的宿主细胞(易感细胞)，细胞受到病毒感染攻击后会产生细胞病变效应(CPE)，细胞发生病变，死亡，并从培养皿底部脱落。在抗病毒活性药物的干预下，未发生病变的细胞附着在培养皿上，利用结晶紫染料，可使活细胞染色，再用脱色液将染料脱出，通过测定其OD值来反映细胞附着在培养皿上的存活状态。将处于对数生长期的WISH细胞消化，用含10％FBS的MEM培养液调整细胞浓度，接种于96孔培养板中，37℃，5％CO2，孵育24小时。以PBS清洗后，分别加入以2％FBS的MEM培养液稀释调配的含有受试品HH-IFN-003或参比品PegIntron的血清样本，每个浓度设三复孔，并设无药物对照孔，继续培养24小时。加入以2％FBS的MEM培养液稀释调配的100倍TCID50(50％细胞感染量)的病毒，并设无病毒感染正常细胞孔和病毒感染对照组，继续培养24小时，中性红染色后甲醛固定，洗涤后用脱色液溶解，在540nm处得到吸光度(OD)值。根据不同稀释度的待测样品抵抗病毒感染发生的细胞病变(CPE)的保护能力，计算出干扰素抵抗病毒感染抑制率(％)，并得到半数有效保护浓度(EC50)。实验结果：食蟹猴单次皮下给药10μg·kg^-1HH-IFN-003后各时间点血清抗病毒活性的绝对值高于同剂量的PegIntron。见表3、图2。这个结果表明，由于HH-IFN-003血药浓度要高于同剂量的PegIntron，因此其体内的抗病毒药效也优于PegIntron。表3食蟹猴皮下给药单剂量PegIntron以及HH-IFN-003后血清抗病毒活性-时间变化的比较ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>